게놈 조작된 Nicotiana benthamiana에서 모노테르펜 인돌 알칼로이드 생합성의 재구성

커뮤니케이션 생물학 5권, 기사 번호: 949(2022) 이 기사 인용

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모노테르펜 인돌 알칼로이드(MIA)는 의학적으로 중요한 여러 화합물을 포함하는 다양한 종류의 식물 천연물입니다. 우리는 Nicotiana benthamiana의 중앙 대사에서 모든 MIA의 핵심 중간체인 스트릭토시딘의 경로를 재구성하기 시작했습니다. 이 숙주의 단점은 풍부한 배경 대사로 인해 일부 이종 생산 분자가 유도체화된다는 점입니다. 여기서 우리는 전사체 분석을 사용하여 생합성 중간체에 반응하여 상향 조절되는 글리코실트랜스퍼라제를 식별하고 이를 코딩하는 유전자에 표적 돌연변이가 있는 식물 계통을 생산합니다. 이들 계통에서 초기 MIA 경로의 발현은 보다 유리한 제품 프로필을 생성합니다. Strictosidine 생합성은 성공적으로 재구성되었으며, 14개 효소의 공동 발현을 통해 최고의 수율을 얻었으며, 이 중 Nepeta(catmint)의 주요 라텍스 단백질 유사 효소(MLPL)는 이리도이드 경로를 통한 흐름을 개선하는 데 중요합니다. 내인성 글리코실트랜스퍼라제의 제거는 스트릭토시딘의 수율에 영향을 미치지 않으며, 이는 안정적인 생합성 중간체로의 경로 효소의 대사 흐름이 숙주의 내인성 대사를 조작할 필요성을 최소화한다는 것을 강조합니다. planta에서 스트릭토시딘의 생산은 생물학적 합성이 가능한 MIA 제품의 범위를 확장합니다.

엔지니어링 식물 시스템에 합성 생물학 접근 방식을 적용하면 생합성 경로의 제어 및 발현이 촉진되어 식물이 대체 생화학 생산 섀시 역할을 할 수 있게 되었습니다1,2. 담배의 친척인 N. benthamiana3,4는 식물 기반의 제약 단백질 생산 및 대사 경로 재구성2에 선호되는 종으로 나타났습니다. 성공에는 트리테르페노이드6의 그램 규모 생산과 에토포시드7의 밀리그램 규모 생산이 포함됩니다. 그러나 여러 연구에서 옥시다제 및 글리코실트랜스퍼라제와 같은 내인성 N. benthamiana 효소의 표적 외 활성에 의해 생성된 것으로 추정되는 의도하지 않은 부산물의 축적이 보고되었습니다8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18. 일부 연구에서 내인성 효소의 활성이 새로운 분자를 생산하거나 알려진 효소의 부족을 보완하기 위해 활용되었지만 대부분의 경우 분자의 유도체화는 표적 화합물의 잠재적 순도와 수율을 감소시키는 단점이 있습니다.

모노테르펜 인돌 알칼로이드(MIA)는 3000개 이상의 식물에서 생산된 천연 제품이 확인된 대규모 그룹입니다20. 이 종류의 분자에는 중독, 심장 질환, 치매, 통증, 암, 말라리아 및 당뇨병을 치료하는 데 사용되는 의학적으로 가치 있는 많은 화합물이 포함되어 있습니다. 가장 특징적인 MIA 생성 식물은 Catharanthus roseus(Madagascar periwinkle)로, 화학요법으로 사용되는 생리활성 빈블라스틴 및 빈크리스틴을 포함하여 130개 이상의 MIA를 생성합니다. 그러나 이러한 귀중한 분자는 C. roseus(0.0005% 건조 중량)21에 낮은 농도로 존재하므로 가용성이 제한됩니다. C. roseus 세포의 대량 배양이 가능하지만 이러한 항암 분자를 지속적으로 생산하는 세포주는 아직 보고되지 않았습니다. C. roseus 식물의 일시적 발현23 및 안정적인 유전적 형질전환24 방법이 보고되었지만, 이들 화합물의 수율을 높이기 위해 자생 식물 숙주를 유전적으로 조작하는 것은 기술적으로 여전히 어렵습니다. 더욱이, 많은 MIA의 구조적 복잡성은 화학적 합성이 종종 어렵다는 것을 의미합니다25,26. 결과적으로, 생산을 위한 대체 경로가 바람직하며 최근 빈블라스틴 경로에서 누락된 단계가 발견되면서 이종 숙주에서의 경로 재구성이 점점 더 매력적인 옵션이 되었습니다.

치료적으로 유용한 양의 MIA 생산을 달성하려면 경로의 초기 부분을 통해 대사 흐름을 최대화하는 경로 공학이 필요합니다. Strictosidine은 3000개 이상의 알려진 MIA가 모두 파생되는 마지막 일반적인 생합성 중간체입니다. 미생물에서 ~11단계 생합성 경로를 재구성하려면 효소 발현 조건과 균주 최적화의 광범위한 조정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 게라니올 8-수산화효소(G8H)의 발현 불량은 효모의 스트릭토시딘 생산을 방해합니다30. 스트릭토시딘 외에 추가로 16개 이상의 효소의 발현이 필요한 빈블라스틴과 같은 분자의 유용한 수율을 얻으려면 상당한 엔지니어링이 필요할 수 있지만, 효모는 최근 29개 발현 카세트의 게놈 통합을 통해 아즈말리신을 생산하도록 조작되었습니다. 식물 천연물 생합성 경로의 이종 재구성 가능성31.

95. Scale bar represents the number of substitutions per site. A tree with all taxa and bootstrap values is provided in Supplementary Fig. 1./p>60 fold while supplementation of GPPS improved yield ~5 fold. DXS supplementation did not change the amount of strictosidine produced (Fig. 1)./p>60 fold while supplementation of GPPS improves yield ~5 fold. c the total ion chromatogram of leaf tissue infiltrated with the entire pathway to strictosidine (including DXS, GPPS, and MLPL). The peak at 4.09 min retention time in the total ion chromatogram (TIC) and extracted ion chromatogram (EIC) at 531.2336 m/z matches a strictosidine standard. N.D., not detected; 7-DLH, 7-deoxyloganic acid hydroxylase; LAMT, loganic acid O-methyltransferase; SLS, secologanin synthase; TDC, tryptophan decarboxylase; STR, strictosidine synthase. Values and error bars represent the mean and the standard error of n = 3 or n = 6 biological replicates (independent leaf samples)./p> 0.993). Putative identification of metabolites was based on the acquisition of high-resolution mass spectrometry data to determine the best fit elemental composition using the Data Analysis software (Bruker)./p>327 amino acids and including an intact Plant Secondary Product Glycosyltransferase (PSPG) box. Protein sequences of 107 UGTs from Arabidopsis thaliana were obtained from the A. thaliana cytochrome P450, cytochrome b5, P450 reductase, b-glucosidase, and glycosyltransferase site (http://www.p450.kvl.dk) as in described33. An additional 9 UGT sequences previously reported to have activity on geraniol or other iridoid substrates from Actinidia deliciosa (kiwifruit)77, Camellia sinensis (tea)78, C. roseus79, Gardenia jasminoides (Cape jasmine)80, Sorghum bicolor81, Vitis vinifera (grape)82,83 were also included. Sequences and accession numbers are listed in Supplementary Table 8. The 193 sequences were aligned using MUSCLE 3.8.425 (Edgar 2004) and a phylogenetic tree with 100 bootstraps was generated using RAxML version 8.2.1184 within the Geneious program. Phylogenetic trees were visualized using Interactive Tree Of Life (iTOL)85./p>